Vitamin D ist ein fettlöslicher Steroidhormon-Vorläufer, der hauptsächlich in der Haut durch die Einwirkung von Sonnenlicht synthetisiert wird. Vitamin D ist biologisch inert und muss nacheinander zwei Hydroxylierungsschritte in Leber bzw. Niere durchlaufen, damit das biologisch aktive 1,25‑Dihydroxy-Vitamin D entsteht. Vitamin D ist für die Gesundheit der Knochen unentbehrlich. Bei Kindern kann ein schwerer Mangel zu Knochenerweichung (Rachitis) führen. Vitamin-D-Mangel verursacht zudem Muskelschwäche (Myasthenie) und erhöht bei älteren Menschen das Risiko zu stürzen. Auch  ist Vitamin D für die Kalziumaufnahme aus der Nahrung verantwortlich. 

Der grösste Teil des im zirkulierenden Blut messbaren 25‑Hydroxy-Vitamin D kommt als 25‑Hydroxy-Vitamin D₃ vor, wohingegen 25‑Hydroxy-Vitamin D₂ nur bei Patienten messbar nachgewiesen werden kann, die Vitamin D₂ als Nahrungsergänzungsmittel zu sich nehmen. Vitamin D₂ gilt als weniger wirksam. Da 25‑Hydroxyvitamin D im menschlichen Körper die hauptsächliche Speicherform ist, besteht allgemeiner Konsens, diesen Metaboliten für die Bestimmung des Gesamtstatus an Vitamin D heranzuziehen. Die Halbwertszeit des zirkulierenden 25‑Hydroxyvitamin D beträgt 2‑3 Wochen.